NADP蘋果酸脫氫酶(NADPMDH)測試盒微量法

本公司所有產(chǎn)品僅供科學(xué)實(shí)驗(yàn)，不做其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)外的使用！
商品屬性：

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物， 連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD-依賴的MDH和NADP-依賴的MDH， NADP-MDH主要存在于真核細(xì)胞中。
測定原理：
NADP-MDH催化NADPH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一、提取液 100 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑二、液體 20 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑三、粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量

（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，

加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟:

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、檢測工作液的配制：用時(shí)在試劑三中加入 19mL 試劑二和 0.5mL 蒸餾水，充分混勻待用；

用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

3、測定前將檢測工作液在 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本和 195μL 工作液，混勻后立即記錄 340nm

處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 1min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

注意：若 A1-A2 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，使 A1-A2 小于 0.5，可提高檢測靈敏度。

計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

NADP-MDH 活力單位的計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=6430×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP-MDH 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=6430×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣÷V樣總×500）÷T=12.86×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：

比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：

反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

1、血清（漿）NADP-MDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=12860×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP-MDH 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=12860×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=12860×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

NADP-MDH（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=25.72×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；

T：反應(yīng)時(shí)間，1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；500：細(xì)胞或細(xì)

菌總數(shù)，500 萬。

生化試劑盒的使用注意事項(xiàng)：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測對象選擇合適的試劑盒，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，避免誤用或浪費(fèi)。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽光直射、高溫或潮濕等不利因素。

控制實(shí)驗(yàn)條件：在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度、時(shí)間、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

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