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冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；

5．如果細(xì)胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實(shí)驗(yàn)報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

 GPR56 / TM7LN4 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 RET Kinase 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 AGRP / AgRP 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 CD93 / C1QR1 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 EGF / Epidermal Growth Factor 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 CD59a / MAC-IP 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 CD79B / B29 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 LRIG1 / LIG-1 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

小鼠 CD33 / Siglec-3 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 CD93 / C1QR1 細(xì)胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠陰莖白膜成纖維細(xì)胞白凡士林 醫(yī)用級5-羧基熒光素琥珀酰亞酯 90%Anti-DDB2/FITC  熒光素標(biāo)記損傷DNA結(jié)合蛋白2抗體IgG

黃凡士林 醫(yī)用級5(6)-羧基熒光素 95%Anti-DDC/FITC  熒光素標(biāo)記多巴脫羧抗體IgG

氫加蘭他敏 98%5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞酯 96%Anti-DEC-205/CD205/Ly75/FITC  熒光素標(biāo)記CD205抗體IgG

2,2,6-基-4H-1,3-二噁英-4-酮 90%6-羧基熒光素琥珀酰亞酯 90%Anti-Dectin-1/CLECSF12/FITC  熒光素標(biāo)記C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員A抗體IgG

Amberlite? IR-120陽離子交換樹脂 鈉型6-羧基四甲基羅丹明 for fluorescence, ≥90%Anti-Dectin-2/CLECSF10/CLEC6A/FITC  熒光素標(biāo)記C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族6成員A抗體IgG

Amberlyst® 15離子交換樹脂 濕6-羧基四甲基羅丹明琥珀酰亞酯 for fluorescenceAnti-Dectin-1/CLECSF12/RBITC  紅色熒光素羅丹明標(biāo)記C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族7成員A抗體IgG

Amberlite® XAD16非離子型大孔樹脂 20-60 mesh4,’6-二脒基-2-苯基 98%Anti-DDX4/MVH/FITC  熒光素標(biāo)記DDX4抗體IgG

Amberlite XAD7HP 離子交換樹脂 Mesh 20-60二氫羅丹明123 95%Anti-Defensin Beta1/FITC  熒光素標(biāo)記防御素β1抗體IgG