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冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

 CD3E & CD3G Heterodimer 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

甲型流感 H7N9 (A/Shanghai/1/2013) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

甲型流感 H7N9 (A/Anhui/1/2013) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

食蟹猴 IGFBP5 / IGFBP-5 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

食蟹猴 CDH18 / Cadherin-18 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

食蟹猴 ANGPTL7 / Angiopoietin-like 7 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠 UNC5B / UNC5H2 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

狗 IL22RA1 / IL22R 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

狗 ANGPTL7 / Angiopoietin-like 7 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

狗 ANGPTL7 / Angiopoietin-like 7 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠胃平滑肌細胞FAM50B蛋白抗體Human CMAS (N-acylneuraminate cytidylyltransferase) ELISA KIT對基-α-D-半乳糖苷

形成素2抗體（成蛋白）Human CCNYL3 (Putative cyclin-Y-like protein 3) ELISA KIT5-尿苷二二鈉鹽

脂閥結構蛋白1抗體Human CDK16 (Cyclin-dependent kinase 16) ELISA KITDL-蘋果酸鈣

成纖維生長因子17抗體Human CAND1 (Cullin-associated NEDD8-dissociated protein 1) ELISA KIT移液器P20，單道大龍移液器P20

成纖維生長因子23抗體Human CCNYL2 (Cyclin-Y-like protein 2) ELISA KIT鐵

成纖維生長因子20抗體Human CWF19L1 (CWF19-like protein 1) ELISA KIT人可溶性凋亡相關因子配體（sFASL）ELISA試劑盒,

成纖維生長因子19抗體Human CRELD1 (Cysteine-rich with EGF-like domain protein 1) ELISA KIT人α干擾素（IFN-α）ELISA試劑盒,IFN-α ELISA kit

成纖維生長因子22抗體Human CLMP (CXADR-like membrane protein) ELISA KIT人抗肝可溶性抗原抗體（SLA）ELISA試劑盒,SLA ELISA