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冷凍保存細胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法；

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理；

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕；

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率；

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

 MICA 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠 CD32b / FCGR2B 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 EPOR & CD131 Homodimer 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 FLRT2 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠 CRP / C-reactive 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 SECTM1 / K12 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 FAM3D 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

 SerpinA6 / CBG 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

甲型流感 H1N1 (A/New York/18/2009) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

甲型流感 H1N1 (A/New York/18/2009) HA 細胞裂解液 (陽性對照) (變性)

大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細胞1號染色體開放閱讀框163抗體Human FAM164C ELISA Kit人α乳清蛋白（α-La）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框172抗體Human EYA4 ELISA Kit小鼠轉(zhuǎn)氨/谷丙轉(zhuǎn)氨（ALT/GPT）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框2抗體Human EYA3 ELISA Kit小鼠腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅱ（TNFsR-Ⅱ）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框19抗體Human EZH1 ELISA Kit小鼠抗心磷脂抗體IgA（ACA-IgA）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框25抗體Human EXOSC2 ELISA Kit大鼠白介素1（IL-1）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框31抗體Human F4/80 ELISA Kit大鼠組織型纖溶原激活劑（t-PA） ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框51抗體Human EYA1 ELISA Kit大鼠3（VD3）ELISA試劑盒,

1號染色體開放閱讀框52抗體Human EYA3 ELISA Kit大鼠FMS樣激3配體（Flt3L）ELISA試劑盒,