1、準(zhǔn)備工作

 

　　在開(kāi)始任何實(shí)驗(yàn)之前，仔細(xì)閱讀并理解所用熒光探針PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)。不同品牌和類(lèi)型的試劑盒可能有要求或優(yōu)化條件。確保所有需要的試劑和設(shè)備都已準(zhǔn)備好，包括但不限于模板DNA/RNA、引物、探針、酶混合物、緩沖液以及所需的耗材如PCR管或板。此外，檢查所有儀器是否正常工作，比如熱循環(huán)儀應(yīng)經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)以保證溫度控制的準(zhǔn)確性。

 

　　2、樣本處理與質(zhì)量控制

 

　　高質(zhì)量的樣本是獲得可靠結(jié)果的基礎(chǔ)。對(duì)于RNA樣品，建議先進(jìn)行DNase處理以去除潛在的基因組DNA污染；而對(duì)于DNA樣品，則需評(píng)估其純度和濃度，通常通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量A260/A280比值來(lái)確定。理想的比值應(yīng)在1.8至2.0之間。同時(shí)，對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂專(zhuān)_保PCR反應(yīng)體系中的核酸量處于推薦范圍內(nèi)。

 

　　3、試劑配制與加樣

 

　　按照說(shuō)明書(shū)指示，準(zhǔn)確配制PCR反應(yīng)混合物。這通常涉及將酶、緩沖液、dNTPs、引物和探針等成分按比例混合。注意避免反復(fù)凍融酶制劑，并盡量減少操作時(shí)間以防酶活性喪失。使用無(wú)菌技術(shù)小心地向每個(gè)PCR管或孔中加入適量的反應(yīng)混合物和樣本，確保無(wú)氣泡產(chǎn)生且各孔間無(wú)交叉污染。使用帶濾芯的移液器吸頭可有效防止這種污染。

 

　　4、運(yùn)行PCR與數(shù)據(jù)分析

 

　　設(shè)置好熱循環(huán)儀的程序參數(shù)，包括變性、退火和延伸溫度及時(shí)長(zhǎng)，具體數(shù)值依據(jù)所用引物和目標(biāo)序列特性調(diào)整。啟動(dòng)PCR后，實(shí)時(shí)監(jiān)控?zé)晒庑盘?hào)變化，記錄Ct值（閾值循環(huán)數(shù)）。Ct值反映了目標(biāo)序列在反應(yīng)中被檢測(cè)到的時(shí)間點(diǎn)，較低的Ct值表示較高的起始拷貝數(shù)。完成PCR后，利用配套軟件分析數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣本中的目標(biāo)序列濃度。