內(nèi)氏放線菌PCR試劑盒PCR定量檢測常見問題的常見原因

1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因：

1) RNA模板質(zhì)量低

2) 對mRNA濃度估計過高

3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

4)同位素磷32過期

5)反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl

2. 擴增產(chǎn)物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

1)zui常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系

3) 與反應(yīng)起始時RNA的總量及純度有關(guān)

4) 建議在試驗中加入對照RNA

5) 第yi鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進行PCR擴增時，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10

6) 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第yi鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進行有效延伸。

7) 目的mRNA中含有強的轉(zhuǎn)錄中止位點，可以試用以下方法解決：

a. 將第yi鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第yi鏈反應(yīng)。

3. 產(chǎn)生非特異性條帶

1)用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

2)在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

3)由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶

1)在PCR反應(yīng)體系中第yi鏈產(chǎn)物的含量過高

2)減少引物的用量

3)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

4)在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

1)大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

2)對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6. 在無反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結(jié)果